Fluorescensmikroskopi: principerna för metoden

Absorption och återemission av lätta ytterligare oorganiska och organiska vätskor är ett resultat av fosforescens eller fluorescens. Skillnaden mellan det fenomen är varaktigheten av intervallet mellan absorption och emission av ljusflödet. När fluorescens av dessa processer inträffar nästan samtidigt, medan fosforescens - med viss fördröjning.

historisk information

I 1852, brittisk vetenskapsman Stokes, beskrivna första fluorescens. Han introducerade en ny term som ett resultat av experimenten med flusspat, som avger rött ljus under ultraviolett ljus. Stokes noterade ett intressant fenomen. Det visar sig att våglängden hos den fluorescerande strålningen alltid är större än flödet av excitationsljuset.

För att bekräfta hypotesen i 19th century har det funnits många försök. De visade att en mängd prover fluorescerar under inverkan av ultraviolett ljus. Bland de material, bland annat varit kristaller, hartser, mineraler, klorofyll, råa droger, oorganiska föreningar, vitaminer, oljor. Den direkta användningen av färgämnen för biologiska tester började först 1930,

Fluorescensmikroskopi: description

Några av de material som används i den första hälften av 20 studier talet uppvisade hög specificitet. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Tack vare prestanda, som inte skulle kunna uppnås genom kontrasterande metoder har metoden av fluorescensmikroskopi blivit ett viktigt verktyg inom biomedicinsk och biologisk forskning. Lika viktiga resultat erhölls, och för material.

? Vilka fördelar gör metoden för fluorescensmikroskopi? Med hjälp av nya material har blivit möjligt och val av mycket specifika cell submikroskopiska komponenter. Fluorescensmikroskopi kan detektera enskilda molekyler. En mängd olika färger möjligt att identifiera flera objekt på en gång. Trots den begränsade rumsupplösning av diffraktionsgränsen av utrustningen, vilket i sin tur beror på de specifika egenskaper hos provet, är också fullt möjligt att identifiera molekyler under denna nivå. Olika prover efter bestrålning uppvisar autofluorescens. Detta fenomen används ofta i petro, botanik, halvledarindustrin.

funktioner

Studera djurvävnader eller patogener ofta komplicerade eller för svaga eller mycket starka ospecifik autofluorescens. Värdet i studier förvärvar införande i de materialkomponenter som exciteras vid en specifik våglängd och emittera den nödvändiga ljusflödesintensitet. Fluorokromer fungera som färgämnen med förmåga att oberoende bundna till strukturer (synliga eller osynliga). Således har de en hög selektivitet till målet, och kvantutbytet.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescensmikroskopi har använts i stor utsträckning sedan tillkomsten av naturliga och syntetiska färgämnen. De hade vissa intensitetsprofiler av utsändning och excitation och riktade till specifika biologiska mål.

Identifiering av enskilda molekyler

Ofta under ideala förhållanden kan du registrera ett separat element glöd. För detta, bland andra saker, är det nödvändigt att åstadkomma en tillräckligt låg brus hos detektorn och den optiska bakgrunden. Fluorescein molekyl till fel på grund av fotoblekning kan avge upp till 300 tusen. Fotoner. Vid 20% uppsamlingseffektivitet av processen och kan registrera dem i en mängd av ca 60 tusen.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescensmikroskopi baserat på lavinfotodioder eller elektronisk multiplikation, tillät forskarna att observera beteendet hos individuella molekyler genom den andra, och i vissa fall till och med minuter.

komplexitet

En nyckelfråga till förmån för dämpning av optiskt brus bakgrund. På grund av det faktum att många av de material som används i konstruktionen av filter och linser uppvisar någon autofluorescens har insatser av forskare i ett tidigt skede inriktad på produktion av komponenter med låg fluorescens. Emellertid har efterföljande experiment lett till nya slutsatser. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. I synnerhet, visade det sig att fluorescensmikroskopi, baserat på total inre reflektion, gör det möjligt att uppnå en låg bakgrund och hög intensitet excitationsljus.

mekanism

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Principerna för fluorescensmikroskopi, baserat på total inre reflektion är användningen av evanescent våg eller evanescent. Det sker vid gränsen mellan media med olika brytningsindex. I detta fall passerar ljusstrålen genom prismat. Den har en hög brytningsindex parameter.

Prismat intill den vattenhaltiga lösningen eller glas med låg parameter. Om en ljusstråle riktas mot den i en vinkel som är mer kritisk, är balken totalreflekteras från gränssnittet. Detta fenomen, som i sin tur orsakar nonpropagating vågor. Med andra ord, det alstrade elektromagnetiska fältet som tränger in i ett medium med ett lägre brytningsindexparametern till ett avstånd mindre än 200 nanometer.

Den evanescenta vågen intensiteten av ljuset skulle vara tillräcklig för att excitera fluoroforer. Men på grund av sin extremt liten djup, kommer dess volym vara mycket liten. Resultatet är en låg nivå bakgrund.

modifiering

Fluorescensmikroskopi är baserat på total inre reflektion, kan implementeras med epi-belysning. Detta kräver objektiv med hög numerisk apertur (åtminstone 1,4, men det är önskvärt att den nådde 1,45-1,6), och partiellt belysta fältet apparat. Det senare uppnås med en liten punktstorlek. För större likformighet med användning av en tunn ring, som blockeras av en del av strömmen. För den kritiska vinkeln, efter vilken det finns en total reflektion, behöver vi en hög nivå av brytnings nedsänkning mediet i linsen och täckglas av mikroskopet.