BildningVetenskap

Molekylär genetisk undersökningsmetod

Att utforska och identifiera varianter i DNA-struktur som används molekylärgenetisk metod. För varje DNA-region, som undersöker denna region av kromosomen, gen eller allel, metoderna skiljer sig åt. Underliggande varje molekylär genetisk metod innefattar några eller annan manipulering av RNA och DNA. Alla dessa metoder kännetecknas av en enorm komplexitet, utan laboratorieförhållanden inte kan genomföras, och personalen måste vara mycket kvalificerad. Detta arbete sker i flera steg.

stadier

Först, för att RNA- eller DNA-prover framställas. Här kan en molekylärgenetisk metod appliceras på praktiskt taget vilket material som helst: en droppe blod, leukocyter, fibroblaster kultur, slemhinnor (skrapas), även de hårsäckar, - DNA kan erhållas från något prov. Är det lämpligt att använda några molekylärgenetiska metoder och deras olika alternativ och har länge isolerat DNA förvaras frysta. Det andra steget är tillägnad ackumuleringen av de önskade fragmenten (amplifiering) av DNA, eftersom det hjälper till att säkerställa polymeraskedjereaktion in vitro (in vitro utan inblandning av levande organism). Som ett resultat, de valda DNA-fragment multiplicerar med denna kedjereaktion, och mängden av DNA ökar bokstavligen miljontals gånger.

Det tredje steget i de molekylära genetiska forskningsmetoder antas multiplicerade DNA-restriktions (denna fragmentering, rivning eller skärning). Restriktion utfördes genom elektrofores på en polyakrylamid eller agarosgel. Denna molekyl-genetisk metod för att studera DNA-fragmentet ger alla möjlighet att ta en viss position i gelén. Därefter gelén behandlades med etidiumbromid, kan binda till DNA, och sedan är det bestrålningen med ultraviolett ljus möjligt att observera luminiscens portioner. Molekylärgenetiska diagnostiska metoder är varierande och många, men de två första stegen är gemensamma för alla. Men för att identifiera DNA-fragment, kan gelen färgas, och många andra befintliga metoder.

arter

Den mest direkta och utbredda metoder för att detektera mykobakterier kan innefatta ovanstående molekylära genetiska DNA inlärningsmetod. Dess väsen är att det, för att identifiera den avsökningskedjan materialet av specifika fragment av DNA av patogener. Molekylärgenetiska diagnostiska tekniker ännu inte har ett mer effektivt sätt att identifiera sådana sjukdomar som tuberkulos. Använda polymerase chain reaction (PCR), kan du vara säker på att den ursprungliga DNA kommer att öka antalet kopior i en miljon gånger, det vill säga det blir förstärkning, och det kommer att visa resultaten. Känslighetsnivån är mycket hög - mer än nittiofem procent, vilket är den största fördelen med denna metod.

Resten av molekylgenetiska metoder för forskning om effektiviteten i avkastning flera kopior bokstavligen fördubblats, eftersom utarbetandet provet i detta fall visar en specifik oligonukleotidsekvens ökade till etthundra sex gånger. Även odlings diagnos av tuberkulos i andningsorganen avsevärt sänka dess känslighet. Det är därför den moderna medicinen är baserad på molekylärgenetiska metoder för diagnos av tuberkulos. Ett beskrivna metoden är effektiv, särskilt när det handlar om patogener med hög antigen variabilitet, bestämma att andra sättet är mycket svårare - kräver särskilda näringsmedier och odla lång tid. Biokemiska och molekylära genetiska metoder producerar mycket olika effekt på resultaten.

diagnos av tuberkulos

Marshall PCR diagnos av tuberkulos vanligast att använda de DNA-sekvenser som är specifika för alla fyra typer av sjukdomen. Att uppnå detta mål använder ofta primrar som detekterar sekvensen IS element (IS-986, IS-6110), som dessa egenskaper utmärker ständigt vandrande arter Mycobacterium tuberculosis och alltid närvarande flera kopior i genomet. Också DNA-extraktion kan utföras från rena kulturer och kliniska (sputum av patienterna) genom någon annan lämplig metod. Till exempel, det Boom metod där lysbufferten används baserad på guanidintiocyanat och kiseldioxid som bärare-DNA. Antalet patienter som skiljer sig dålig bakteriologiska ökar för varje år, och därför i klinisk praxis har etablerat en helt annan nivå av organisation: molekyl genetisk metod för att studera DNA har spelat en viktig roll i diagnosen.

Men vi måste erkänna att det är inte utan nackdelar. PCR-metoden är att använda ofta ger ett stort antal falska positiva resultat, och orsaken är inte bara tekniska fel, men också funktioner i själva metoden. Dessutom, med användning av denna metod för diagnos för att bestämma viabiliteten hos mykobakterier, som har identifierats, är det helt enkelt omöjligt. Men denna nackdel är inte det viktigaste. Molekylärgenetiska metoder för PCR-diagnostik medföra risk för kontaminering av mykobakteriellt DNA. Certifieringskrav av denna anledning som för PCR-laboratorier avsedda uteslutande hårt, kräver de tre separata lokaler. PCR-tekniken är modern och mycket komplex, det kräver användning av lämplig utrustning och högt utbildad personal.

bacterioscopy

När diagnosen analysresultaten måste jämföras med andra data: klinisk undersökning, röntgen, smeta mikroskopi, beskära och även svar på en specifik behandling är mycket viktiga. I denna serie, är PCR-studier endast en av komponenterna. Identifiera patogenen i tidig diagnos kan vara de enklaste och snabbaste sätt - bakteriologiska.

Det används ett ljusmikroskop (färgning Ziehl-Neelsen) och fluorescerande (färgande fluorokromer). Fördelen är hastigheten smear resultaten. Men dess nackdel med rätta anses vara den begränsade kapaciteten på grund av låg känslighet. Emellertid är denna metod ges WHO: s rekommendation som den mest ekonomiska och marken för att detektera tuberkulospatienter. Detektion av mykobakterier bakteriologisk metod har förutsägelsevärden och beräknade kvantitativt bakteriell utsöndring. Mycket mer övertygade om att ta itu med det molekylärgenetiska forskningsmetoder av tuberkulos.

kulturer

Bättre detektion av mykobakterier erkänner kulturstudier. Sådd patologisk material den är gjord i ägget medium: Mordovsky, Finn II, LJ och liknande. Riktmärken för motstånd av mykobakterier till läkemedel och indirekta bevis för effektiviteten av ett antal mykobakterier och deras kolonier in vitro, om den tillämpade metoden för forskningskultur. Att öka andelen av isolering av mykobakterier inokulering av patologiskt material hålls på flera miljöer.

Tillgodose behoven hos många kulturella, patogen inklusive bidrag och vätskor. Används i detta system och automatiserad mätning typ VANTES tillväxt. Grödor måste hållas i odling under upp till sju till åtta veckor. Vid denna tid kan anses vara grödan med bristen på tillväxt negativ. Det mest effektiva sättet för att detektera Mycobacterium tuberculosis in de biologiska prover: diagnostiska material Infect marsvin, som är extremt känsliga för TB.

några siffror

Intressant studieområde, som öppnades av PCR-diagnostik var att studera M. tuberculosis - latent infektion. Den moderna begreppet TB-infektion tyder på att av hundra personer som var i kontakt med M. tuberculosis, nittio kan mycket väl vara smittade, men bara tio av dem är aktiv sjukdom utvecklas. Andra har TB immunitet, och eftersom nittio procent av fallen infektionen förblir latent. Detektera ett mönster det har hjälpt en molekylär genetisk metod.

Genetiker säger att femtiofem procent av dem vars grödor patologiskt material var negativa, och åttio procent av människor som infekterats med M. tuberculosis, men flyter utan röntgen manifestationer av sjukdomen, fick PCR positiva svar. Det är en genetisk diagnostisk metod hjälpt till att identifiera riskpatienter genom PCR studier, med resultaten av sina analyser (mikroskopi och kultur) var negativ, och subklinisk infektion M. tuberculosis var närvarande.

modern forskning

Ryska federationen och bakteriologiska laboratorier använder en accelererad metod för absoluta koncentrationer: nitratreduktas aktiviteten hos mykobakterier testats av Griess-reagens. Anti-TB sjukhus använder en metod som gör det möjligt att bestämma läkemedelsresistens. Denna sådd i flytande medier, där automatiserad radiometriska och fluorescerande redovisningssystem tillväxt av mykobakterier. En sådan analys görs snabbt - upp till två veckor.

Närvarande, är nya metoder utvecklas: läkemedelsresistens av mykobakterier mäts vid genotypen nivå. Studie av de molekylära mekanismerna för resistensgener och visar närvaron i mykobakterier. Dessa gener är associerade med resistens mot vissa läkemedel. Till exempel, Kasa gener, Inha, katG resistent mot isoniazid, rpoB-genen - rifampicin 16Sp RNA-gener och rpsL - streptomycin, EMB1 - till etambutol, gyrA - en fluorokinolon och så vidare.

mutationer

Den moderna diagnos ökade signifikant nivå metoden molekyl genetisk för att studera DNA och får utföra storskaliga studier av mutationer i alla deras spektrum. Nu vet vi att de vanligaste mutationerna i 516, 526 och 531 kodon rpoB-genen och identifierade motståndskraft mot olika läkemedel. Det finns en hel rad metoder för typning av mykobakterier med hjälp av inte bara traditionella metoder - biokemiska, biologiska och kulturella, men också används i stor utsträckning moderna molekylärgenetiska metoder. Redan finns det adekvat och ge en korrekt diagnos metod för detektion av monogena sjukdomar. De är baserade på DNA-studier i exakt område av en viss gen. Detta är vanligtvis en komplex process, tidskrävande och dyra, men de data som tillhandahålls genom molekylär genetisk analys, är mycket mer exakt och informativ än data för alla andra analyser.

Det har länge varit känt att DNA inte förändras under hela organismens liv att det är i alla kärn celler odnakova, och detta gör det möjligt att ta analysen av absolut alla celler i kroppen, i något skede av ontogeni. Den skadade genen kan upptäckas före uppkomsten av de första symptomen till fullskalig klinisk sjukdom, liksom hos friska heterozygota personer, men har en mutation i genen. Molekylära genetiska ärftlig sjukdom diagnostiska metoder medger att avslöja sina (direkt tillvägagångssätt, DNA-diagnostik), samt för att analysera segregeringen av sjukdomen i familjen med markör-loci-DNA (genetiska polymorfismer), som är nära förbunden med en skadad gen (dvs den indirekta tillvägagångssätt av DNA-diagnostik). Direkt eller indirekt - eventuella DNA-diagnostik är baserad på de metoder för att identifiera en strikt definierad del av den humana DNA.

direkta metoder

Direkta metoder för DNA-diagnos är när gärningsmannen genen ärftlig sjukdom är känd, såsom är välkänt, och olika typer av dess mutationer. Till exempel, en lämplig direkta metoder i ett antal sjukdomar. Denna Huntingtons korea (förlängning CTG-repetitioner), fenylketonuri (R408W), cystisk fibros (delF508, större mutationer) och liknande. Den största fördelen med den direkta metoden är ett helägt diagnostisk noggrannhet, och det finns ingen anledning att göra en DNA-analys av resten av familjen. Om en mutation i motsvarande gen hittas, gör det exakt godkänna en diagnos av ärftlighet, genotyp bestämning för resten av belastade familjen.

En annan fördel med direkt diagnos anses identifiera en heterozygot bärare av dåliga mutationer från släktingar och föräldrar som dött av sjukdomen. Detta gäller särskilt för sjukdomar autosomalt recessivt. Nackdelar med direkta metoder finns också. Att tillämpa dem, måste du veta exakt lokalisera den onormala genen exon-intron strukturen hos dess spektrum och dess mutationer. Inte alla monogena sjukdomar i dag har fått sådan information. Informativeness direkta metoder kan inte anses vara fullständig, eftersom en och samma gen kan ha ett stort antal patologiska mutation som orsakar utveckling av ärftliga sjukdomar.

indirekta metoder

Indirekta metoder inom DNA-diagnostik används alls, i andra fall, om den skadade genen inte har identifierats, men endast kromosomalt eller om linjen diagnos inte gav resultatet (det händer, om genen komplexa molekylära organisation eller i stor utsträckning, om det finns en hel del patologiska mutationer). Indirekta metoder utförs segregation analys av polymorfa markörer i allel familj. Markörer som finns i samma kromosomala region eller lokus är nära kopplad till sjukdomen och representerar deletioner eller insertioner, punkt substitutioner, upprepningar, och deras polymorfism beror på olika mängd av celler i blocket.

Mest praktiskt för indirekt diagnos anses mikro och minisatellit polymorfism, som ofta distribueras i det mänskliga genomet. deras värde uttryckt i högt informationsinnehåll, om skador på det genetiska avståndet mellan markören och genen inte är för stor. I det senare fallet, är uppskattningsnoggrannhet bestäms i stor utsträckning frekvensen av rekombination mellan den polymorfa markören och skador. Indirekta diagnostiska metoder ger också obligatoriskt förberedande steg av allel-frekvenser av den analyserade populationen studien bland patienter och bärare av mutationer, plus nödvändigheten av att bestämma sannolikheten för rekombination av nonequilibrium och vidhäftnings markörer och mutanta alleler.

andra metoder

Korta segment av RNA eller DNA, såväl som enda gen visualiseras vid mikroskopisk undersökning kan inte vara, därför, för att identifiera mutationer som behövs genom molekylär genetisk diagnos. Det finns en "Human Genome Project", liksom andra framsteg inom molekylär genetik kraftigt utökad möjlighet diagnos av ärftliga sjukdomar - både pre- och postnatal. Dessa metoder kan ge tidig upptäckt och göra en förutsägelse poly- och monogena sjukdomar, vars debut sker i vuxen ålder. Tyvärr, på grund av de tekniska möjligheterna hos molekylärgenetiska studier är ibland utanför de etiska gränser som är inställda i förhållande till arv, speciellt när diagnosen är i tonåren och barndomen.

Strukturella och numeriska kromosomavvikelser är de vanligaste orsakerna till sjukdom och cancer, och många missbildningar. Kromosomavvikelser måste identifieras, vilket är viktigt för familjerådgivning - att bedöma prognosen tillsammans med reproduktiv risk i framtida graviditeter. Kromosomanalys är "gold standard" av genetisk diagnos, men det är begränsat. Endast metoder för molekylärgenetisk analys kan göra mer, eftersom det används kloningsteknik baserad fluorescerande markörer kan deras höga känslighet för att identifiera subtila kromosomförändringar som är omöjliga att upptäcka klassiska cytogenetiska studier. Dessa tekniker alltmer expanderar våra diagnostiska möjligheter, när de undersöks, barn med utvecklingsstörning, utvecklingsstörning, med många andra ärftliga sjukdomar.

rön

Det är mycket viktigt för mänskligheten var den gen struktur och funktion av kunskap, typer av variabilitet, förmågan att detektera ärftliga sjukdomar som inträffade i samband med utvecklingen av molekylär genetik. dess metoder är inriktade på studier av DNA-molekylen - och när det är normalt, och när den är skadad. Framställning av deoxiribonukleinsyra sekvenser av nukleotider (DNA) sträcker sig i etapper från att ta emot prover för att identifiera individuella fragment. Isolering av genom-DNA från cellerna, begränsning (tårflöde), amplifiering (kloning), elektrofores av fragmenten (separera deras elektriska laddning och molekylvikt genom agarosgel). Identifiering av specifika fragment belägna på ytan av ett diskret rand.

Sedan få in i lagen speciella filter, genom vilka passerar varje fragment hybridisering med klonade DNA-fragment eller syntetiska radioaktiva prober är en kontroll, som kommer att vara lika med varje testprov. Om du ändrar position eller längd jämfört med sonden, om en ny fragment eller försvunnit - allt detta tyder på att den analyserade genen har genomgått en omstrukturering i nukleotidsekvensen. Det finns åtta grundläggande tekniker för molekylärgenetiska studier: sekvense (bestämning av DNA-sekvensen), polymeraskedjereaktion (ökning av antalet sekvenser), framställningen av primers kända gener, DNA-kloning, produktion av rekombinanta molekyler härledda proteiner på grund av rekombinanta molekyler, vilket skapar en komplett uppsättning (insamling bibliotek) klonat fragment som erhölls genom användning av restriktions.

Similar articles

 

 

 

 

Trending Now

 

 

 

 

Newest

Copyright © 2018 sv.birmiss.com. Theme powered by WordPress.